hTERT基因啟動子調控HSV

時間：2024-09-11 04:59:18 藥學畢業論文我要投稿

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hTERT基因啟動子調控HSV

作者：卞卡，張惠中，任繼鴻，趙輝，成詩銀

【關鍵詞】端粒,末端轉移酶；啟動區（遺傳學）；宮頸腫瘤；tk基因
【Abstract】 AIM: To observe the killing effect of HSVtk/GCV system on cervical carcinoma cells under the control of hTERT(human telomerase reverse transcriptase) core promoter. METHODS: An eukaryotic expression vector containing HSVtk gene under the control of hTERT core promoter was constructed and was transfected into cervical carcinoma cells(HeLa) and vessel endothelial cells(ECV304) by liposome method. Transfected cells were then selected with G418 and RTPCR was used to detect the tk gene expression in HeLa cells and ECV304 cells. After GCV was added, flow cytometry method were applied to investigate its cell killing effect. RESULTS: pCIneo/hTERTtk/GCV system under the control of hTERT induced the apoptosis in more than 36.7% of cervical carcinoma cells, but not in normal vessel endothelial cells. CONCLUSION: hTERT gene core promoter is tumorspecific and may be useful in tk gene therapy of cervical carcinoma and in reducing the side effects of the therapy.
【Keywords】 telomerase; promoter regions (genetics); cervix neoplasms; tk gene
【摘要】目的：研究人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因核心啟動子調控的人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋（HSVtk/GCV）系統對宮頸癌細胞的體外殺傷作用.方法：構建hTERT基因啟動子調控的tk基因真核表達載體pCIneo/hTERTtk，分別用脂質體法轉染宮頸癌細胞(HeLa)和正常血管內皮細胞（ECV304），新霉素（G418）篩選陽性克隆擴增. 用RTPCR法比較兩種細胞tk基因的表達情況；給予前藥更昔洛韋（GCV），用流式細胞術檢測hTERT調控的HSVtk/GCV系統對兩種細胞的殺傷作用. 結果： hTERT啟動子調控下的HSVtk/GCV系統對宮頸癌HeLa細胞有明顯的殺傷作用，使36.7%的細胞凋亡；而對正常細胞ECV304作用則不明顯. 結論： hTERT啟動子調控的tk基因治療是一種具有腫瘤特異性的治療方法，有望解決腫瘤基因治療中的特異性殺傷及降低毒副作用等問題.
【關鍵詞】端粒，末端轉移酶；啟動區（遺傳學）；宮頸腫瘤；tk基因
0引言
宮頸癌是死亡率較高的惡性腫瘤,傳統治療方法以手術、化療、放療為主,但晚期不宜手術者及對放化療不敏感者5 a生存率仍不理想. 隨著分子生物學及相關技術的迅速發展,自殺基因療法在腫瘤治療中取得了一定療效，其利用人單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋（human simplex virusthymidine kinase/ganciclovir, HSVtk/GCV）將更昔洛韋（ganciclovir, GCV）等前藥磷酸化為細胞毒產物,從而阻止細胞DNA合成, 殺傷腫瘤細胞［1-2］. 有研究發現，由于缺乏特異性，tk基因修飾的正常組織細胞經前藥治療后會與腫瘤細胞一起被殺死，造成對正常組織的殺傷. hTERT基因在90%的人類腫瘤組織中呈過表達［3］，具有明顯的腫瘤特異性.我們采用克隆hTERT基因啟動子，利用其在腫瘤細胞中特有的啟動活性來控制HSVtk的腫瘤特異性表達的方法，旨在實現其在腫瘤細胞中的特異性殺傷作用.
1材料和方法
1.1材料Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶以及電泳中所用marker DL2000和DGL2000均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自日本Promega公司；質粒提取、純化試劑盒購自北京天為時代公司；轉染試劑盒LipofectamineTM2000購自美國Introvigen公司；含人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因與tk基因的pGL3 Basic質粒由第四軍醫大學唐都醫院耳鼻喉科韓明鯤饋贈；pCIneo質粒由第四軍醫大學唐都醫院腎內科楊潔饋贈；GCV購自廣東麗珠集團；大腸桿菌菌株JM109，宮頸癌細胞HeLa和臍靜脈內皮細胞ECV304均由第四軍醫大學唐都醫院臨床實驗科提供；流式細胞儀美國Coulter公

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