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SiRNA穩定抑制肝癌細胞hTERT基因的表達
【關鍵詞】 肝腫瘤Stable inhibition of hTERT gene by siRNA in hepatocarcinoma cells
【Abstract】 AIM: To elucidate the timeefficiency relation of stable inhibition of hepatocarcinoma cell proliferation by RNA interference in vitro. METHODS: The stable screeninginhibition technique of RNAi was adopted to suppress the expression of hTERT stably. After small hairpin RNA (shRNA) targeting hTERT gene was designed, recombinant vector pGenesilshRNAhTERT was constructed and transfected into hepatocarcinoma SMMC7721 cells, which were stably selected by G418 to establish hepatocarcinoma cell lines stablely expressing pGenesilshRNAhTERT. Realtime RTPCR, MTT and PCRTRAP were utilized to detect the alterations of hTERT mRNA expressions, telomerase activity and cell proliferation. RESULTS: The effectiveness of RNAi existed continually and stably in hepatocarcinoma SMMC7721 cells expressing stably pGenesilshRNAhTERT. In the cell lines expressing stably pGenesilshRNAhTERT, hTERT mRNA was obviously suppressed, and the telomerase activities were significantly decreased. Hepatocarcinoma SMMC7721 cell proliferation significantly inhibited in pGenesilshRNAhTERT group compared to that in negative control group. CONCLUSION: RNAi may continually and stably suppress hTERT mRNA expression and carcinoma cell proliferation, which is a potential new approach for antitumor gene therapy.
【Keywords】 RNA interference; liver neoplasms; telomerase
【摘要】 目的： 利用RNA干擾穩定篩選抑制技術，抑制人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）基因表達，探討靶向hTERT基因RNAi與抑制肝癌細胞增殖的時效關系. 方法： 設計靶向hTERT基因的小干擾RNA，構建重組表達質粒pGenesilshRNAhTERT并導入肝癌SMMC7721細胞株，經G418篩選，建立穩定表達siRNAhTERT的細胞株. 采用realtime RTPCR、MTT和PCRTRAP法同時檢測pGenesilshRNAhTERT穩定抑制組和未處理SMMC7721細胞組hTERT基因表達、端粒酶活性及細胞增殖變化. 結果： 在穩定表達pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721細胞株中，RNAi效力持續、穩定存在，hTERT mRNA表達、端粒酶活性明顯降低，瘤細胞增殖被抑制. 結論： RNA干擾能持續、穩定地抑制靶基因hTERT mRNA表達及腫瘤細胞增殖，是有潛力的基因治療腫瘤新方法.
【關鍵詞】 RNA干擾；肝腫瘤；端粒，末端轉移酶
0引言
端粒酶的異常表達與惡性腫瘤的發生發展和預后密切相關［1］， hTERT基因在肝癌中的表達陽性率為89.5%［2］. 研究表明hTERT的高表達能通過多分化刺激來抑制細胞凋亡，導致細胞永生化［3］. 我們依據RNA干擾（RNA interference, RNAi）原理，使用短發夾樣RNA（small hairpin RNA, shRNA）設計的RNAiDNA載體方法［4］，以hTERT基因為靶點，構建穩定表達小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA) 的肝癌SMMC7721細胞株，從體外研究siRNA穩定、特異誘導hTERT基因轉錄后沉默，逆轉癌細胞惡性表型的能力，探討RNAi基因治療惡性腫瘤的時效性.
1材料和方法
1.1材料
肝癌SMMC7721細胞株購自上海細胞生物研究所. 質粒pGenesil1購自武漢晶賽生物工程技術有限公司. 限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ購自Roche公司,總RNA提取試劑、轉染試劑LipofectamineTM2000等分別購自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHyb Kit購自華美生物工程公司. Taqman探針和引物由Takara公司合成，hTERT及內參PO的探針和引物序列參照文獻［4］. siRNAhTERT轉錄模板由上海博亞公司合成.
1.2方法
shRNA發夾結構序列長度為69 bp，兩端分別為BamHⅠ, HindⅢ酶切位點，中間為9 bp莖環序列分隔的反向重復靶序列，并以6個T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉錄終止子. 質粒構建采用BamHⅠ, HindⅢ雙酶切空質粒pGenesil1，將shRNAhTERT轉錄模板5′AAGTTCCTGCACTGGCTGATG3′（AF 015950 nucleotides 16821702）和陰性對照轉錄模板5′AAGCTTCATAAGGCGCATAGC3′ （與人基因無同源性）分別設計成發夾結構，定向克隆至該載體上，經篩選、酶切鑒定后，進行測序確定，命名為pGenesilshRNAhTERT，陰性對照命名為pGenesilshRNAPK. 質粒轉染與G418篩選采用LipofectamineTM2000脂質體轉染法. 操作按說
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