復方牡蠣根管充填糊劑的皮膚致敏性觀察
作者：劉夢冬 鄧婧 許曉燕 孫慧斌 尚偉【摘要】 目的 評價一種新型根管充填糊劑——復方牡蠣糊劑潛在的皮膚致敏性。方法 采用豚鼠最大劑量試驗方法，選用健康白色豚鼠40只，隨機分為陰性對照組、粉劑組、混合物組、陽性對照組（各10只），分別于皮內注射9 g/L氯化鈉溶液、材料粉劑浸提液、材料混合物浸提液、50 g/L 甲醛溶液與完全弗氏佐劑的乳化液，進行初次致敏，1周后進行二次致敏，于二次致敏后第14天進行激發接觸，分別于24、48、72 h后觀察注射處皮膚有無紅斑、水腫現象，并計算致敏率。結果 陰性對照組、粉劑組與混合物組動物均無明顯致敏反應，陽性對照組出現明顯紅斑、水腫現象。粉劑組致敏率10%，混合物組的致敏率為0。結論 復方牡蠣糊劑作為根管充填糊劑無潛在的皮膚致敏性。
【關鍵詞】 根管充填材料；皮膚致敏試驗；殼聚糖；豚鼠
根管治療術的臨床療效與根管充填糊劑的性能有密切的關系。目前，國內臨床上常用的根管充填糊劑各有優缺點，傳統的根管充填材料（氧化鋅丁香油糊劑、根管充填糊劑）雖然價格低廉，但有不少弊端。國外產品（如紅糊，Vitapex）雖然性能優越，但價格昂貴，難以在國內普及。復方牡蠣糊劑是將傳統中藥牡蠣粉與羧甲基殼聚糖混合制成的一種糊劑，具有根管充填糊劑所應有的多種特性，并可能修復根尖周組織。該材料作為根管填充材料應用于臨床需要進行系列的實驗研究。本文根據ISO?10993?1標準[1]，對該材料的必測項目——皮膚致敏性進行研究，以對其生物相容性進行初步的檢測。
1 材料和方法
1.1 材料
牡蠣殼粉（生物碳酸鈣），產自渤海灣，細度200目，由中國海洋大學提供；羧甲基殼聚糖，由中國海洋大學提供；CO2恒溫細胞培養箱（National Appounce）、完全弗氏佐劑（FCA，SIGMA?ALDRICH CO.），均產自美國。
健康白色豚鼠40只（上海斯萊克實驗動物有限公司提供），體質量300～500 g，隨機分為4組，分別為粉劑組、混合物組、陰性對照組和陽性對照組，每組10只。
1.2 方法
1.2.1 材料制備 將牡蠣殼粉作為材料的粉劑，將500 mg 羧甲基殼聚糖加熱溶解于10 mL雙蒸水中(50 g/L），作為該材料的液劑。將牡蠣殼粉過200目篩孔后與羧甲基殼聚糖液按1.5∶1.0 (V/V)的比例混合調成糊狀，待其凝固作為該材料的混合物。根據我國國家標準GB/T16886.5?1997的規定，將材料粉劑及調合固化24 h的混合物粉碎后，經高溫、高壓消毒，按0.2 kg/L的比例溶于9 g/L氯化鈉溶液中，配成200 g/L的溶液，置37 ℃細胞培養箱24 h，取其上清液即為材料浸提液。取完全弗氏佐劑按照1∶1比例分別與材料浸提液及9 g/L氯化鈉溶液和50 g/L 甲醛溶液均勻混合，制備成混合乳化液。
1.2.2 初次致敏 根據豚鼠最大劑量試驗方法的要求，對各組動物采用相同處理方式皮下注射試劑: 在豚鼠背部剪毛4 cm×6 cm，消毒后于肩胛骨內側從頭向尾成對地注射6個點，每點注射0.1 mL, 陰性對照組注射完全弗氏佐劑與9 g/L氯化鈉溶液的乳化液，陽性對照組注射完全弗氏佐劑與甲醛的乳化液，粉劑組注射材料粉劑浸提液與完全弗氏佐劑等體積乳化物，混合物組注射混合物浸提液與完全弗氏佐劑的乳化液。
1.2.3 二次致敏 試驗第7天同區域剪毛，100 g/L十二烷基硫酸鈉涂布各注射點，24 h后各注射點涂布相應的被試液。
1.2.4 激發接觸 于二次致敏后第14天，在豚鼠腹部剪毛2 cm×4 cm，消毒后于皮內注射相應被試液0.1 mL，注射后24、48、72 h觀察注射點情況。
1.2.5 致敏性評價 按照皮膚反應程度評分標準對各注射點的反應程度記分，評分標準如下:無紅斑水腫記為0分，輕度紅斑水腫記為1分，中度紅斑水腫記為2分，嚴重紅斑水腫記為3分，紫紅色斑并有焦痂形成、重度水腫、皮膚隆起記為4分。
皮膚致敏試驗以致敏率表示致敏的程度, 致敏率是反應評分為1分或以上的動物數占該組動物總數的百分比，即致敏率=致敏動物數/動物總數×100%。并按Mafhusson 致敏率分級標準分級：致敏率0～8% 為Ⅰ級，弱致敏物；致敏率9%～28%為Ⅱ級，輕度致敏物；致敏率29%～64% 為Ⅲ級，中度致敏物；致敏率65%～80%為Ⅳ級，強致敏物；致敏率81%～100%為Ⅴ級，極強致敏物。
2 結果
陽性對照組致敏動物數為10只；陰性對照組致敏動物為0只；粉劑組致敏動物數為1只，致敏率為10%,按致敏率分級標準分度為Ⅱ度，為輕度致敏物；混合物組致敏動物數為0只，無致敏性。
3 討論
在皮膚致敏反應過程中，半抗原滲透入皮膚，與皮膚蛋白質結合后具抗原性。皮膚內的郎罕細胞將抗原傳遞給特異型淋巴細胞，其中具有長壽命的記憶細胞在激發階段作為原始活性因子，以后再接觸同一抗原時，致敏的淋巴細胞釋放淋巴因子，吸引炎細胞至局部產生反應，導致一系列有害反應。本試驗采用皮內注射的方法減少了機體免疫系統對待測材料的影響，可以重新組合致敏物，具有較高的可靠性，是致敏試驗的首選方法。豚鼠最大劑量試驗是國際上評價化學物引起皮膚致敏作用的經典方法，在我國已列入國家標準。本試驗參照ISO 10993?10標準[2]，選用白色豚鼠作為實驗動物。豚鼠血清中含有豐富的補體，是實驗動物中補體含量最多的一種動物，其補體非常穩定。因此，豚鼠皮膚對刺激反應敏感，且其遲發性超敏反應與人類相似。其中2～3月齡、體質量為350～400 g的豚鼠最適合用于過敏反應的研究。
弗氏佐劑是免疫學上廣泛應用的油類佐劑，分為完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑兩種。完全弗氏佐劑是在不完全佐劑的基礎上加一定量的分支桿菌制成。它的高度佐劑活性是其他物質難以相比的，可使正常狀態下無免疫原性的物質成為免疫原，并能啟動細胞免疫。完全弗氏佐劑作為一種增強免疫反應的藥物，可以最大限度地放大免疫反應的程度，對于材料致敏性的檢測有較高的準確性、靈敏性和可靠性。
根管充填材料與活體組織接觸后，不可避免地會與體液、組織間液發生作用，對活體產生影響。本試驗選用9 g/L氯化鈉溶液作為浸提遞質，使待測材料浸提液的性質盡可能與實際情況相似。
本試驗復方牡蠣糊劑未顯現出皮膚致敏性與該材料的性質有關。羧甲基殼聚糖是殼聚糖分子中引入羧甲基得到的一種水溶性殼聚糖衍生物，它具有良好的生物相容性，并對多種口腔重要厭氧菌有抑制作用[3]。而且它可直接作用于骨母細胞，促進其分化和骨礦物質的合成，提高堿性磷酸酶的活性，加速骨基質的形成和修復作用。在降低血糖水平方面也有顯著的作用[4]，在醫學各個領域正在日益得到廣泛的應用[5]。在口腔醫學中，已有學者在研究其在齲病防治、蓋髓術和牙周病方面的應用[6]。
牡蠣粉是海洋甲殼類動物牡蠣的外殼研磨所形成的粉劑。其主要成分是碳酸鈣，含多種微量元素與氨基酸的復合物，其組成與根管壁的成分相近，可提供大量的鈣離子。將牡蠣粉與羧甲基殼聚糖聯合應用具備根管充填劑應具備的一些特性，將其應用于根管治療有著良好的理化性能和生物學基礎。
在本試驗中，粉劑組中有個別位點出現輕微過敏反應，這可能與牡蠣粉中成分多樣，而其中完全弗氏佐劑又最大限度放大了材料的致敏性，以及動物對致敏原個體差異性有關。
本試驗僅為該材料系列研究中的一部分，能否應用于臨床，尚需通過其他的實驗研究以對其進行客觀綜合的評價而定。
【參考文獻】
[1]ISO10993?1: Biological evaluation of medical devices?part 1: Evaluation and Testing[S]. 3rd ed. Switzerland:ISO copyright office, 2003：8.
[2]ISO10993?10: Biological evaluation of medical devices?part 10: Tests for irritation and Sensitization[S]. 2nd, Switzerland:ISO copyright office, 2003:15.
[3]唐濤,薛毅,信玉華,等. 羧甲基殼聚糖對口腔重要厭氧菌的抑菌性能評價[J]. 中國微生態學雜志, 2003,15(6):337?339.
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[5]綦秀芬,劉桂菊,李恩澤. 甲殼質及其衍生物在醫藥方面的應用[J]. 齊魯醫學雜志, 2002,17(4):364?366.
[6]劉曉勇,李玉晶,趙寶榮. 用甲殼胺直接蓋髓的實驗研究[J]. 現代口腔醫學雜志, 2001,15(5):336?338.
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